Alterações proteômicas de fibroblastos e células endoteliais após incubação com corpos densos subvirais de citomegalovírus humano

Dados científicos volume 10, número do artigo: 517 (2023) Citar este artigo

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O citomegalovírus humano (HCMV) é um patógeno de alta relevância médica. Os Corpos Densos Subvirais (DB) foram desenvolvidos como uma vacina candidata para melhorar as consequências graves da infecção pelo HCMV. O desenvolvimento de uma vacina candidata para aplicação humana requer conhecimento detalhado da sua interação com o hospedeiro. Uma análise abrangente baseada em espectrometria de massa (MS) foi realizada em relação às alterações no proteoma de células de cultura celular, expostas ao DB.

O citomegalovírus humano (HCMV) é um β-herpesvírus e a principal causa de infecções congênitas em todo o mundo, resultando em uma série de sequelas, como perda auditiva, déficits visuais ou distúrbios cognitivos1. No contexto da imunossupressão sistêmica, a infecção pelo HCMV pode resultar em morbidade e mortalidade substanciais1. Os fibroblastos infectados com HCMV liberam grandes quantidades de partículas não infecciosas, denominadas Corpos Densos, no sobrenadante da cultura celular . Análises por espectrometria de massa de DB isolados contribuíram para a elucidação de sua composição proteica e revelaram a presença de antígenos importantes da resposta imune adaptativa contra o CMVH4,5. Enquanto isso, experimentos in vitro e estudos em animais mostraram que os DB são notavelmente imunogênicos e induzem uma resposta robusta de interferon (IFN)6,7,8,9,10,11. Consequentemente, o DB tem sido considerado uma vacina promissora contra o HCMV12,13. No que diz respeito à aplicação humana de uma vacina candidata em ensaios clínicos e para o licenciamento final, é importante um conhecimento abrangente sobre o impacto da vacina nas células hospedeiras para avaliar potenciais efeitos adversos e tolerabilidade. Conjuntos de dados sobre o impacto do DB na cultura de fibroblastos e células endoteliais foram gerados usando espectrometria de massa (MS). Esses conjuntos de dados foram utilizados em uma publicação anterior que se concentrou na investigação da resposta do Interferon-β e na indução da expressão do gene estimulado pelo Interferon (ISG) em fibroblastos e células endoteliais após exposição ao DB.

Os fibroblastos primários do prepúcio humano (HFF) foram estabelecidos a partir do prepúcio de um recém-nascido em 1994 e foram utilizados para pesquisas no passado6,7,14,15,16. A aprovação para usar essas células nos estudos foi obtida do comitê de ética do conselho médico da Renânia-Palatinado, Alemanha. Os HFF foram mantidos em meio essencial mínimo (MEM; Gibco-BRL, Glasgow, Escócia) suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (FCS), 100 mg/l de L-glutamina, 0,5 ng/ml de fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e gentamicina (5 mg/l). Para as experiências, foram utilizados números de passagem de células HFF entre 16 e 19. As células HEC-LTT foram estabelecidas por Dagmar Wirth e colaboradores17. As células foram derivadas de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) que foram imortalizadas condicionalmente com expressão dependente de tetraciclina do antígeno T grande SV40 e transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT). Para cultivo, os recipientes de cultura foram revestidos com gelatina a 0,1% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;) durante pelo menos 30 minutos. As células HEC-LTT foram mantidas em meio de crescimento endotelial (EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd., Basel, Suíça) suplementado com 2 μg/mL de doxiciclina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). A proliferação de células HEC-LTT pode ser controlada pela doxiciclina (DOX). A adição de DOX ativa a expressão das proteínas imortalizantes hTERT e antígeno T grande SV40, resultando na proliferação celular. A doxiciclina foi omitida durante todos os experimentos. A permissão para usar células HEC-LTT para fins de pesquisa foi concedida através de um acordo de transferência de material pelo Centro Helmholtz para Pesquisa de Infecções (HZI). As células mostraram-se permissivas à infecção pelo HCMV18. O HEC-LTT foi gentilmente enviado a nós por Christian Sinzger (Instituto de Virologia, Centro Médico da Universidade de Ulm, Ulm, Alemanha) e usado para experimentos da passagem 41 à passagem 55.