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Scientific Reports volume 13, Artigo número: 11652 (2023) Citar este artigo

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A edição do genoma CRISPR é uma ferramenta poderosa para elucidar funções biológicas. Para modificar o genoma conforme pretendido, é essencial compreender os vários modos de recombinação que podem ocorrer. Neste estudo, relatamos inserções vetoriais complexas que foram identificadas durante a geração de alelos condicionais por edição CRISPR usando junção final mediada por microhomologia (MMEJ). O vetor de direcionamento continha duas sequências loxP e microhomologias flanqueadoras de 40 pb. As regiões genômicas correspondentes às sequências loxP foram clivadas com Cas9 em células-tronco embrionárias de camundongo. A triagem por PCR para recombinação direcionada revelou uma alta frequência de bandas de tamanho maior do que o esperado. O sequenciamento de nanoporos dessas bandas revelou inserções complexas de vetores mediadas não apenas por MMEJ, mas também por união de extremidades não homólogas e recombinação homóloga em pelo menos 17% dos clones. Uma nova banda apareceu após a melhoria das condições de PCR, sugerindo a presença de alelos modificados involuntariamente que escapam à triagem de PCR padrão. Isto nos levou a caracterizar a recombinação de cada alelo dos clones editados pelo genoma usando polimorfismos heterozigotos de nucleotídeo único, levando à confirmação da presença de alelos homozigotos. Nosso estudo indica que é necessário um controle de qualidade cuidadoso de clones editados pelo genoma para excluir a inserção de vetores complexos e não intencionais no alvo.

Nos últimos anos, a tecnologia de modificação do genoma progrediu muito com o advento do sistema CRISPR1. No entanto, é sempre possível que ocorra recombinação não intencional na edição do genoma CRISPR. Portanto, o controle de qualidade dos clones editados pelo genoma é importante para garantir que a recombinação pretendida nos clones não seja acompanhada por recombinação não intencional. A recombinação não intencional pode ocorrer no local alvo da recombinação ou em regiões genômicas distantes do local alvo. O último tipo de recombinação ocorre frequentemente em sequências genómicas semelhantes à sequência alvo devido ao emparelhamento parcial de RNAs guia (gRNAs). Tal recombinação é referida como efeitos “fora do alvo” e vários métodos foram desenvolvidos para detectá-la2,3. Em relação à antiga recombinação “no alvo” não intencional, foram relatadas grandes exclusões no local alvo . Tipicamente, os recombinantes de interesse são rastreados por PCR. Portanto, grandes deleções genômicas que acompanham a perda dos sítios de ligação dos iniciadores de PCR podem passar despercebidas. Recentemente, foram relatados outros tipos de recombinação não intencional no alvo, nos quais vetores de gRNA ou DNA mitocondrial são inseridos no local de clivagem genômica alvo . Embora os locais de ligação do iniciador de PCR tenham sido preservados nestes casos, a inserção da sequência exógena não intencional passou despercebida na triagem inicial de PCR porque o tamanho do amplicon de PCR estava acima do limite de detecção. Essa recombinação não intencional no alvo precisa ser cuidadosamente examinada, especialmente quando se pretende a edição bialélica do genoma, já que a perda do alelo de tipo selvagem (wt), conforme verificado pela análise de PCR, pode ser causada não pela edição homozigótica do genoma, mas pela combinação de alelos pretendidos. recombinação em um alelo e recombinação não intencional no outro alelo.

No presente estudo, relatamos padrões de inserção de vetores complexos e não intencionais no alvo que identificamos no processo de geração de alelos condicionais para o sistema Cre / loxP em células cultivadas. Para gerar um alelo condicional, duas sequências loxP devem ser inseridas, uma a montante e outra a jusante da região genômica alvo. Além disso, para realizar análises fenotípicas em células cultivadas, ambos os alelos devem ser modificados da mesma forma. Assim, um total de quatro sítios loxP precisam ser inseridos no genoma. Diferentes vias de reparo, isto é, recombinação homóloga (HR), união de extremidades não homólogas (NHEJ) e união de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ), podem ser empregadas para introduzir sequências estranhas no genoma. HR é a via mais amplamente utilizada e requer um braço de homologia de 500–1000 pb no vetor de direcionamento9. É relatado que a via da FC está ativa principalmente desde a fase S tardia até a fase G2 do ciclo celular . Em contraste, a via NHEJ está ativa durante todo o ciclo celular. Portanto, o método baseado em NHEJ permite a inserção direcionada em tipos de células nas quais o método HR é ineficiente, como neurônios, embora a sequência de junção no local de recombinação seja difícil de controlar em comparação com a de HR11. Mais recentemente, foi desenvolvido um método denominado sistema PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) utilizando MMEJ . Este método utiliza braços de microhomologia tão curtos quanto 10–40 bases de comprimento para recombinação. É relatado que a via MMEJ está ativa principalmente desde a fase M até a fase S inicial, permitindo um modo diferente de recombinação em comparação com a FC. Empregamos o método PITCh no presente estudo porque a inserção da sequência loxP de 34 bases no genoma pode ser facilmente detectada por PCR devido ao curto comprimento do braço de homologia do vetor de direcionamento. No entanto, a triagem por PCR revelou bandas de tamanhos não intencionais que eram mais longas do que o esperado em alta frequência. A análise dessas bandas com sequenciamento de leitura longa Nanopore revelou inserções vetoriais complexas envolvendo não apenas MMEJ, mas também HR e NHEJ. O tamanho da sequência do vetor inserida pode estar além do limite de detecção do método padrão de controle de qualidade baseado em PCR para clones editados pelo genoma. Propomos que a recombinação involuntária no alvo detectada neste estudo precise ser cuidadosamente excluída na fase de controle de qualidade da edição do genoma.