Desenvolvimento de ácido nucleico peptídico

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12482 (2023) Citar este artigo

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Numerosos novos métodos para detectar patógenos de origem alimentar foram extensivamente desenvolvidos para garantir a segurança alimentar. Entre as importantes bactérias de origem alimentar, Bacillus cereus foi identificado como um patógeno preocupante que causa várias doenças alimentares, levando ao interesse no desenvolvimento de métodos eficazes de detecção para este patógeno. Embora esteja disponível um método padrão baseado em cultura e testes bioquímicos de confirmação, é demorado e trabalhoso. Métodos alternativos baseados em PCR foram desenvolvidos, mas carecem de capacidade de alto rendimento e facilidade de uso. Este estudo, portanto, tenta desenvolver um método robusto para detecção de B. cereus, aproveitando os ácidos nucleicos do peptídeo pirrolidinil (PNAs) altamente específicos como sondas para um método de matriz de esferas com capacidade multiplex e de alto rendimento. Neste estudo, os PNAs contendo a estrutura do ácido prolil-2-aminociclopentanocarboxílico (ACPC) com sequências groEL, motB e 16S rRNA foram acoplados covalentemente com três conjuntos de esferas fluorescentes com código de barras para detectar os três genes de B. cereus. O conjunto de esferas baseado em acpcPNA desenvolvido exibiu boa seletividade onde apenas sinais foram detectáveis ​​na presença de B. cereus, mas não para outras espécies. A sensibilidade deste ensaio de esferas baseado em acpcPNA na detecção de DNA genômico foi de 0,038, 0,183 e 0,179 ng para groEL, motB e 16S rRNA, respectivamente. Este desempenho foi claramente superior ao seu homólogo de DNA, confirmando assim uma força de ligação muito mais forte do acpcPNA sobre o DNA. A robustez do método desenvolvido foi ainda demonstrada testando leite enriquecido artificialmente e mostarda em conserva com interferência mínima de métricas alimentares. Conseqüentemente, este método de prova de conceito de matriz de esferas baseado em acpcPNA provou servir como um método alternativo eficaz baseado em ácido nucleico para patógenos de origem alimentar.

Bacillus cereus é um dos principais patógenos de origem alimentar que pode ser encontrado em uma ampla gama de produtos alimentícios, desde alimentos prontos para consumo, alimentos fermentados e laticínios1. Devido à sua tolerância a pH e temperatura extremos, B. cereus foi comumente encontrada em vários estágios de processamento de alimentos2, resultando em graves surtos de origem alimentar em todo o mundo, com uma prevalência global de até 23,746%. Na Europa, é a segunda causa do surto de origem alimentar, depois do Staphylococcus aureus3. Nos EUA, cerca de 63 mil pessoas/ano adoeceram com taxa de internação de 0,4% do grupo Bacillus4.

Métodos rápidos e precisos que permitem a monitorização e detecção atempada de B. cereus nos alimentos podem servir como um método chave de mitigação na redução dos seus surtos. Além disso, dado que nem todas as espécies de Bacillus são patogénicas, é imperativo ser capaz de identificar ao nível das espécies de Bacillus5. Embora um método padrão ISO 7932:2004 esteja disponível com base no protocolo de contagem baseado em placa de ágar6, este método é demorado e trabalhoso (exigindo um período de incubação de até 24 horas a 30 °C com mais 2–7 dias para confirmação ensaio) e requer profissionais treinados. Métodos moleculares alternativos, como técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR), foram desenvolvidos para identificar B. cereus7,8. No entanto, a maioria desses métodos baseados em PCR depende de métodos de eletroforese em gel de baixa resolução para visualizar produtos de PCR, dificultando a interpretação dos resultados. Muitas técnicas avançadas baseadas em PCR, como PCR quantitativo (qPCR) e PCR multiplex, foram desenvolvidas para superar essas limitações9,10,11, mas sua capacidade multiplex ainda é limitada devido a complicações da formação de dímeros de primers12. Além disso, a maioria dos métodos baseados em PCR depende do DNA como sonda específica, que pode ser degradada por fatores ambientais, como temperatura, pH e enzimas.

Para superar essas limitações, este estudo apresenta um método de detecção para B. cereus, combinando as vantagens da capacidade multiplex e facilidade de aquisição de resultados da técnica de matriz de esferas e ácido nucleico peptídico altamente específico (PNA) como sonda alternativa. A plataforma de matriz de esferas usada neste estudo é baseada em uma tecnologia xMAP de alto rendimento, sensível e multiplex para diferentes tipos de alvos . Este método utiliza esferas paramagnéticas fluorescentes com código de barras funcionalizadas com grupos carboxila para ligação covalente de ligantes nucleofílicos. Cada conjunto de esferas pode ser identificado por um laser vermelho, e o sinal é medido a partir de um repórter fluorescente (R-ficoeritrina) por um laser verde . Em comparação com as técnicas tradicionais de microarranjos de DNA, a tecnologia de arranjo de esferas oferece diversas vantagens. Primeiro, o rendimento desta técnica é claramente maior. Isso ocorre porque ela é considerada semiautomática, enquanto a tecnologia de microarranjos de DNA não o é. Em segundo lugar, devido à sua etapa de lavagem automática, a tecnologia de arranjo de esferas geralmente apresenta menor fundo e maior consistência do que a tecnologia de microarranjos de DNA . Por último, o custo de um detector na tecnologia de arranjo de esferas é muito mais barato que o do microarranjo de DNA, tornando-o mais prático. Como tal, vários sistemas de matriz de esferas baseados em DNA foram aplicados com sucesso para detectar uma ampla variedade de contaminações alimentares, como alérgenos alimentares18, patógenos de origem alimentar na carne de frango19 e quatro patógenos de origem alimentar, incluindo Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus e Shigella. spp. em laticínios20. Curiosamente, o método relatado para detecção de B. cereus exigiu temperatura elevada a 38 ° C para obter sinal detectável, provavelmente devido à menor estabilidade na ligação DNA-DNA em comparação com a ligação PNA-DNA. Isto torna impraticável o processamento industrial real20. Além disso, todos estes métodos de arranjo de esferas relatados utilizaram DNA como sonda específica, cuja especificidade depende significativamente da temperatura de hibridização e do comprimento das sondas . Supomos que o uso de imitadores alternativos de ácidos nucleicos com melhor afinidade de ligação ao alvo de DNA pode melhorar o desempenho geral da detecção.